DNA纳米技术，最新Nature Nanotechnology！

DNA折纸技术能够通过DNA碱基配对精确组装纳米结构，为疾病治疗和诊断提供了全新工具，在药物递送和疫苗设计等领域展现出巨大潜力。然而，其功能发挥依赖于结构的完整性，在体内易受核酸酶降解或低离子环境的影响而解体，目前缺乏在活体内精确评估其结构完整性的方法，这严重阻碍了其向临床应用的转化。

近日，卡罗林斯卡学院Björn Högberg教授课题组提出了一种名为“结构追踪与完整性定量邻近连接分析”（PLASTIQ）的新方法，仅需1微升血液即可解析DNA折纸的结构完整性，检测限低至0.01 fM。利用PLASTIQ，研究人员能够在活体小鼠模型中观察并量化DNA折纸在血液循环中的降解动态，评估聚乙二醇化修饰对其稳定性的提升效果。该技术为在体评估DNA纳米结构的完整性提供了定量工具，有望加速基于DNA纳米技术的治疗药物开发。相关论文以“Resolving DNA origami structural integrity and pharmacokinetics in vivo”为题，发表在《Nature Nanotechnology》上。

研究团队首先在体外验证了PLASTIQ的可行性。他们设计了两种杆状DNA折纸结构，并在其中引入了可连接钉合链对（LSPs）。实验证明，只有当折纸结构保持完整时，相邻的LSPs才能通过连接酶连接并被后续PCR扩增检测到。而传统的针对DNA支架的检测方法（如qPCR）则无法区分完整结构与降解产物。研究还证实，PLASTIQ同样适用于经过聚乙二醇化或紫外线交联修饰的DNA折纸结构，表明其具有良好的兼容性。

图1：使用1微升血液评估DNA折纸完整性的PLASTIQ工作流程示意图。 感兴趣的纳米结构被设计成包含一组可连接钉合链对（LSPs），LSP由两个连续的钉合链组成，由于其中一条链的5‘端带有磷酸基团（以圆圈P表示），它们能够被连接酶连接。LSPs的分布提供了单螺旋分辨率的分辨能力，连接产物可通过测序或qPCR进行扩增和定量。

图2：PLASTIQ评估DNA折纸完整性的体外概念验证。 a， PLASTIQ体外工作流程。LSP包含两个连续的钉合链，其5’端断点处含有用于连接的磷酸基团，两侧为用于混合PCR的突出引物靶向区域（粉色和蓝色）。连接和PCR后，产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析。b， “rod折纸的代表性冷冻电镜图像（左）。比例尺，100纳米。“rod的透射电镜（TEM）显微照片（右）。比例尺，50纳米。c， LSPs在“rod中的位置。d， 来自包含所有9对LSPs（all）或仅单个LSP（编号1-9）的“rod折纸的连接并扩增后的LSPs产物在PAGE凝胶上的结果，用于区分混合PCR的条带。e， 使用靶向支架或LSP的引物，对非变性（ND）或变性（D）的“rod样本进行PCR扩增的PAGE凝胶可视化结果。f， LSPs在“rod中的位置。g， 来自包含所有8对LSPs（all）或仅单个LSP（编号1-8）的“rod折纸的连接并扩增后的LSPs产物在PAGE凝胶上的结果。h， 使用靶向支架或LSPs的引物，对ND或D的“rod样本进行PCR扩增的PAGE凝胶可视化结果。

为了评估PLASTIQ在体内的适用性，研究人员将杆状DNA折纸通过静脉或腹腔注射注入小鼠体内，并在不同时间点采集微量血液进行分析。结果表明，静脉注射后，完整的折纸信号在5分钟即可检出，但随后迅速下降，聚乙二醇化修饰可略微延长其血液循环半衰期。腹腔注射后，信号持续的时间则显著更长，呈现出典型的吸收动力学特征。与传统的荧光标记追踪法相比，PLASTIQ更能真实反映完整结构的药代动力学，因为荧光染料在结构解体后仍会残留，导致信号高估。

图3：使用PLASTIQ追踪体内DNA折纸完整性。 a， 将折纸静脉或腹腔注射到小鼠体内，从同一只动物在不同时间点采集血样，进行PLASTIQ处理、混合PCR扩增以及凝胶分析或测序分析的实验工作流程。b, c， 对静脉注射折纸的小鼠血液中连接LSPs进行混合PCR扩增产物的凝胶分析，包括PAGE（b）和强度（c）分析。不同泳道对应不同时间点采集的血样。圆点代表两个生物学重复。Ctrl是对照，对应注射后5分钟采集但未进行连接步骤的血样。d, e， 对腹腔注射折纸的小鼠血液中连接LSPs进行PCR扩增产物的凝胶分析，包括PAGE（d）和强度（e）分析。不同泳道对应不同时间点采集的血样。圆点代表两个生物学重复。Ctrl是对照，对应注射后5分钟采集但未进行连接步骤的血样。f， 给小鼠注射Alexa 750染料或染料标记的纳米结构后，在不同时间点采集的血样的荧光成像。g， 基于Alexa 750荧光的血液药代动力学曲线。h， 注射后1小时和2小时活体小鼠的荧光成像。I， 染料；II， 染料标记的折纸；III， 染料标记的聚乙二醇化折纸。

通过结合qPCR定量分析每个LSP，PLASTIQ能够动态描绘不同折纸区域在体内的完整性变化。研究发现，不同位置的LSP降解速率存在差异，但整体趋势受注射途径主导。静脉注射后，折纸浓度呈现快速峰值后迅速衰减的模式；而腹腔注射后则呈现先吸收后消除的双相趋势。聚乙二醇化修饰在腹腔注射中促进了早期吸收，但一旦进入循环，也会加速清除。

图4：使用PLASTIQ结合qPCR在体定量DNA折纸完整性。 a， 应用于血样的PLASTIQ工作流程，随后进行qPCR分析。b, c， 静脉注射（b）或腹腔注射（c）后，多只小鼠体内折纸完整性随时间的变化（n=3）。d-g， 展示对单只小鼠个体LSPs定量结果的代表性图表，这些结果用于计算b和c中的平均值。通过qPCR测定静脉注射（d和f）或腹腔注射（e和g）裸“rod（d和e）和聚乙二醇化“rod（f和g）后，每个连接LSP的血液浓度。整体折纸完整性曲线通过对所有连接LSPs的信号取平均生成。

图5：DNA折纸体内药代动力学模型。 a， 基于线性消除动力学的静脉注射模型。b, c， 拟合的连接LSP血液浓度曲线叠加在“rod（b）和“rod（c）的静脉注射实验数据上。d， 基于双室动力学的腹腔注射模型示意图，其中初始的腹膜吸收相之后是血液中的消除相。e, f， 拟合的连接LSP血液浓度曲线叠加在“rod（e）和“rod（f）的腹腔注射实验数据上。g， 模拟定时重复给药（如30分钟注射间隔）下，腹膜腔和血液中给药结构浓度随时间波动的示意图。

为了深入探究折纸内部不同区域的稳定性差异，研究团队设计了一个双层桶状DNA折纸结构，并在其不同区域（顶部、底部、外表面、内表面）布置了LSPs。体内实验结果显示，注射30分钟后，位于折纸结构内表面的LSPs信号显著高于顶部、底部和外表面区域。这表明，受到外部核酸酶攻击更少的内层螺旋结构，其降解速度相对更慢，PLASTIQ技术能够精细地揭示单个DNA折纸颗粒内部的完整性丢失模式。

图6：PLASTIQ揭示双层桶状DNA折纸体内完整性丢失模式。 a， 从不同视角展示的“barrel折纸设计，显示不同位置的颜色编码LSPs。b，“barrel折纸的代表性冷冻电镜图像。比例尺，100纳米。c， 将“barrel通过体外PLASTIQ工作流程处理后，获得的混合PCR扩增产物的PAGE凝胶分析。L，连接产物；NL，未连接的“barrel折纸作为阴性对照。右：条带与颜色编码框匹配，对应“barrel中LSPs的位置，并标有扩增子长度（碱基对）。d，“barrel折纸体内实验的工作流程，包括通过腹腔注射给药、在不同时间点采集血液、通过PLASTIQ处理并进行qPCR扩增。每个LSP含有独特的突出序列，用于qPCR中引物靶向。e， 通过PLASTIQ结合qPCR分析，测定的“barrel中连接钉合链在指定时间点的血液浓度。每个点对应通过不同LSP的qPCR扩增测得的折纸血液浓度（n=3）。条形图表示图例中所示每个“barrel区域的三个LSPs的平均浓度。采用单因素方差分析及Dunnett’s检验进行统计分析（P=0.0481）。

综上所述，PLASTIQ作为一种免标记、高灵敏的方法，首次实现了在活体动物内以单螺旋分辨率纵向追踪DNA折纸的结构完整性。它将分子水平的精确性与生理环境相结合，不仅能够评估完整纳米结构的动态变化，还能揭示结构内部的局部降解差异。这一强大的工具为深入理解DNA折纸在生理环境中的行为、理性设计与优化下一代DNA纳米治疗药物，以及满足相关监管评估要求，奠定了坚实的技术基础。